排阻限

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中文名
排阻限
外文名
exclusion limit
应    用
制备凝胶
拼    音
paizuxian

排阻限基本信息

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凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开,由于它们在分配系数上有显著差异,这种分离又称组别分离,一般可选用SephadexG-25和G-50,对于小和低分子量的物质(1000-5000)的脱盐可使用SephadexG-10,G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离,这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶,层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部,由于Kd不同,最后得到分离。

排阻限分类介绍

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排阻限度 - 简介柱的直径与长度根据经验,组别分离时,大多采用2-30cm长的层析柱,分级分离时,一般需要100cm左右长的层析柱,其直径在1-5cm范围内,小于1cm产生管壁效应,大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间,但对移动慢的物质宜在30-40之间。
  凝胶柱的制备凝胶型号选定后,将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长,加热可使溶胀加速,即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸,1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。
  凝胶的装填:将层析柱与地面垂直固定在架子上,下端流出口用夹子夹紧,柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器,柱内充满洗脱液,将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中,然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内,这样凝胶粒水平上升,直到所需高度为止,拆除柱顶装置,用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间,再开始流动平衡,流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速,千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜,使用前要检查层析床是否均匀,有无“纹路”或气泡,或加一些有色物质来观察色带的移动,如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好,色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
  加样和洗脱凝胶床经过平衡后,在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和,再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%-10%。样品浓度与分配系数无关,故样品浓度可以提高,但分子量较大的物质,溶液的粘度将随浓度增加而增大,使分子运动受限,故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2.样品加入后打开流出口,使样品渗入凝胶床内,当样品液面恰与凝胶床表面相平时,再加入数毫升洗脱液中洗管壁,使其全部进入凝胶床后,将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连,预先设计好流速,然后分部收集洗脱液,并对每一馏份做定性、定量测定。
  凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用,不必特殊处理,并不影响分离效果。为了防止凝如果不再使用可将其回收,一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干,依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上,滤干,再用醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性,密封后高压灭菌保存。
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科技